pUASTattB Cas9発現ベクター (UAS-Hsp70プロモーター）

pUASTattB Cas9発現ベクターの概要

当社のpUASTattBショウジョウバエCas9発現ベクターは、条件付きCas9タンパク質発現のトランスジェニックハエを作製するための非常に効果的なシステムです。このベクターシステムは、CRISPR遺伝子編集のためのCas9発現と、バクテリオファージφC31インテグラーゼを介した組換え、そして強力なGal-4誘導性プロモーターをを組み合わせたものです。

CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9システムは、様々な生物において、in vitroおよびin vivoでの遺伝子の不活性化を大幅に促進してきました。このゲノム編集システムでは、Cas9酵素はガイドRNA（gRNA）と複合体を形成し、ゲノム中の18-22ntの相同な標的配列と直接相互作用することで標的特異性をもたらします。gRNAの標的部位へのハイブリダイゼーションによってCas9が特定の位置に誘導され、ゲノム中の標的部位を切断します。Cas9はゲノムをスクリーニングし、gRNAに相補的な配列（プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM) NGGが直後に続く場合）を切断します。二重鎖切断はその後、相同組換えまたは非相同末端結合によって修復され、その結果、様々な長さのインデル（ゲノム中への塩基の挿入または欠失）が生じます。オールインワン・ベクター（Cas9とgRNAの両方を発現する単一ベクター）、またはCas9とgRNAの発現をそれぞれ駆動するためのベクターをそれぞれ導入するだけで、ショウジョウバエでCRISPR/Cas9システムを利用することができ、ノックアウト系統を短時間で作製することができます。

このpUASTattBシステムは、3つの主要なエレメント： (1) φC31インテグラーゼを介する挿入エレメントattBとattP、 (2) 選択遺伝子発現用のGAL4 結合サイト for selective gene expressionおよび (3) Cas9発現用の.熱ショック誘導性（hsp70）プロモーターから構成されています。

attBベクターシステムは、大腸菌プラスミドとして設計された2つのベクターから構成されています。一つはattBベクター（またはφC31ドナーベクター）と呼ばれ、attB部位とCas9遺伝子を搭載しています。もう一つはヘルパープラスミドと呼ばれ、φC31インテグラーゼをコードしています。attBプラスミドとφC31ヘルパープラスミドをattPランディングサイトを含む細胞に共導入すると、φC31インテグラーゼがattB部位とattP部位間の組換えを仲介し、attBベクターは直鎖化され、宿主ゲノムへ挿入されます。また、ドナーベクターをショウジョウバエφC31インテグラーゼ発現株の細胞に注入することもできます。

バクテリオファージφC31は、ファージの付着部位（attPと呼ばれる）と細菌の付着部位（attBと呼ばれる）の間の効率的な配列特異的組換えを仲介するインテグラーゼをコードしています。P-エレメントを介する転移のようなトランスポゾン系とは対照的に、φC31を介する挿入は不可逆的です。attBがattPの位置に挿入されると、ハイブリッド部位（attLおよびattRと呼ばれる）が形成されるが、これらはφC31インテグラーゼによって認識されなくなります。さらに、φC31に基づく挿入は通常はattP部位のみに限定される部位特異的であり、ゲノムの他の部位では起こりません。このため、attBベクターシステムは、ゲノム内にattP "着地点（ランディングサイト） "をゲノム中に持つショウジョウバエ系統で使用するように設計されています。

GAL4/UASシステムはGal4に依存した発現誘導ができるように設計されています。Gal4タンパク質はCas9の上流にあるUASに結合して転写を活性化します。したがって、Gal4非存在下では下流の遺伝子は転写されませんが、Gal4を発現しているショウジョウバエ株との交配よって転写は活性化されます。

このpUASTattB Cas9発現ベクターでは、Cas9遺伝子はGal4結合サイトが5つ直列に並んだ5xUASとhsp70 TATAボックスプロモーターをつなげた誘導型プロモーター（5×UAS/ Hsp70）の下流にクローニングされます。37℃で培養することでCas9の発現が誘導されます。また、pUASTベクター上のミニホワイト遺伝子は目の色をコードし、導入遺伝子の組換えに成功したトランスジェニックハエを同定するためのマーカーとして使われます。PCRやその他の分子生物学的手法も、トランスジェニック細胞や動物の同定に用いることができます。

ベクターシステムの詳細については、下記の文献をご参照ください。

文献	トピック
Methods Mol Biol. 420:61 (2008)	The use of P-element transposons to generate transgenic flies
Proc Natl Acad Sci U S A. 97:5995 (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97:5995 (1998)	Description of the φC31 integrase system
Proc Natl Acad Sci U S A. 104:3312-7 (2007)	Generation of φC31-based transgenic Drosophila
Science. 339:819-23 (2013)	Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Methods Mol Biol. 2540:135-156 (2022)	CRISPR-mediated genome editing in Drosophila

pUASTattB Cas9発現ベクターの特長

当社のpUASTattB遺伝子発現システムはφC31インテグラーゼによる目的遺伝子の高効率なゲノム挿入とGal4による発現誘導を可能にします。当社のベクターはE.coliでの高コピー数複製とトランスジェニックハエの高効率な作製ができるように最適化されています。

pUASTattB Cas9発現ベクターのメリット

配列特異的な挿入: φC31インテグラーゼはattPサイトで配列特異的な挿入を引き起こしますが、その他のゲノム配列への挿入は起こりません。そのため宿主の遺伝子を破壊する、または挿入部位の位置効果によって導入した遺伝子の発現が影響を受ける危険を減らすことができます。

高い発現量: 5×UAS/mini_Hsp70プロモーターは誘導された状況で、非常に強く目的遺伝子の発現を駆動します。

発現誘導が可能：導入された遺伝子はGal４非存在下でほとんど発現しませんが、Gal４が存在すると高レベルで発現します。

高効率：φC31インテグラーゼをもちいた生殖細胞への遺伝子導入はP因子トランスポゾンを利用したpUASTシステムよりも高効率です。

pUASTattB Cas9発現ベクターのデメリット

発現“漏れ“の可能性: Gal４非存在下でも目的の遺伝子が低いレベルで発現することがあります。

技術的な煩雑さ: トランスジェニックハエの作製は胚へのインジェクションやハエの飼育・交配など、高い技術が要求されます。

attPサイトが必要：pUASTattBベクターシステムをもちいたトランスジェニックハエの作製には、あらかじめattPサイトがゲノムに導入された特別な宿主株が必要です。

pUASTattB Cas9発現ベクターの基本コンポーネント

5×UAS/mini_Hsp70: ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の熱ショックタンパク質Hsp70の最小プロモーターを5×UASに連結したプロモーター。Gal4によって強力に活性化される。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

Cas9: Cas9ヌクレアーゼ（CRISPR-associated endonuclease）、gRNAによって局在した個所でDNAを切断する。

SV40 terminator: SV40（Simian virus 40）のポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写停止を助ける。

attB site: バクテリオファージφC31インテグラーゼによって認識されるattBサイト。φC31インテグラーゼは宿主ゲノムにあらかじめ導入されているattPサイト特異的にpUASTattBプラスミドを挿入する。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

mini-white: ショウジョウバエのwhite遺伝子の派生型。ミニホワイト遺伝子は成体ショウジョウバエの目の色に関する優性マーカーであり、white遺伝子変異体をバックグラウンドとした遺伝子導入の成否の判断に使用する。